L’hybridation ADN-ADN (DDH) a été, durant des années, la méthode de référence pour la démarcation des espèces procaryotes. Un seuil de 70% de similarité ente deux séquences de génome permet l'identification d'une espèce. Des erreurs ont permit l'utilisation d'une nouvelle méthode basée sur le génotype: l'identité nucléotidique moyenne (ANI). 95-96% de similarité de la séquence du gène de l'ARNr 16S correspondait à 70% de DDH. Or, de nombreuses espèces partagent un degré élevé de similarité de séquence du gène de l’ARNR 16S, bien qu’elles soient séparées, rendant difficile la distinction entre deux espèces. La cohérence entre la similarité des séquences du gène de l’ARNr 16S et l'ANI n'a été étudié que sur 70 génomes. Le but est de déterminer le seuil optimal de similarité de la séquence du gène de l'ARNr 16S pour la délimitation des espèces équivalent à 95-96% ANI. Les valeurs ANI ont été utilisé pour estimer le potentiel d'utilisation de l'ANI dans la classification des procaryotes.

L’identification taxonomique de 6787 séquences génomique a été réalisé en calculant la similarité de la séquence du gène de l'ARNr 16S et l'ANI entre les séquences du génome de l’étude et des souches type. Les valeurs ANI ont été calculées entre tous les génomes de souches appartenant à la même famille uniquement. Les calculs d’ANI sont basé sur l’utilisation de BLASTN et de logiciels statistiques. L'association possible entre ANI et la similarité de la séquence du gène de l'ARNr 16S a été testée par régression logarithmique. La détermination du seuil optimal de similarité des séquences du gène ARNr 16S correspondant à un seuil ANI donné pour la démarcation des espèces, est basé sur la mesure F. Elle permettrait de trouver la cohérence entre une taxonomie donnée et son positionnement phylogénétique. Les valeurs de similarité des séquences du gène de l’ARNr 16S ont été réparties en 4 catégories. Le score F le plus élevé a été défini comme seuil optimal final.

Les valeurs de similarité de séquence du gène de l’ARNr 16S et ANI ont présentées deux profils. L’ensemble des valeurs ANI entre les espèces sont supérieures à 96%, marquant la démarcation des espèces. La valeur moyenne ANI a montré un profil identique à celui basé sur tous les génomes, provenant d’espèces différentes. La relation globale entre l’ANI et la similarité des séquences du gène de l'ARNr 16S était non linéaire. Il en était de même avec les séquences de DDH dans des études antérieures. Mais, l'application d’outils statistiques a montré une corrélation linéaire entre l’ANI et la similarité de la séquence du gène de l'ARNr 16S. Le seuil optimal de similarité de séquence, correspondant à 96% de l’ANI, a été validé à 98,65%. Seuil obtenu précédemment avec la similarité de séquence DDH. Des variations intragénomique et interspécifiques parmi les copies du gène ARNr 16S, entraînant un biais du seuil de similarité, ont été révélées.

Il existe un grand nombre d'espèces procaryotes non reconnues à ce jours.
Le seuil de similarité des séquences du gène de l'ARNr 16S dans la reconnaissance de nouvelles espèces a été essentiel dans la taxonomie des procaryotes.
A chaque découvertes d'espèces, la valeur seuil est remise en question.
L'étude menée ici n'a été réalisée que sur un nombre limité de séquences, ce qui représente un biais quant à sa fiabilité.
Le seuil de similitude des séquences du gène de l'ARNr 16S pour définir les espèces de procaryotes devrait permettre la découverte de nouvelles espèces, uniquement s'il est combiné avec des méthode de parenté génomique comme l'ANI.

Les études portées sur la démarcation des espèces de procaryotes confirment que la définition d'espèce biologique n'est pas appliquable aux procaryotes. En 2014, ils ont leur propre définition.