There is a burgeoning repository of information available from ancient DNA that can be used to understand how genomes have evolved and to determine the genetic features that defined a particular species. To assess the functional consequences of changes to a genome, a variety of methods are needed to examine extinct DNA function. We isolated a transcriptional enhancer element from the genome of an extinct marsupial, the Tasmanian tiger (Thylacinus cynocephalus or thylacine), obtained from 100 year-old ethanol-fixed tissues from museum collections. We then examined the function of the enhancer in vivo. Using a transgenic approach, it was possible to resurrect DNA function in transgenic mice. The results demonstrate that the thylacine Col2A1 enhancer directed chondrocyte-specific expression in this extinct mammalian species in the same way as its orthologue does in mice. While other studies have examined extinct coding DNA function in vitro, this is the first example of the restoration of extinct non-coding DNA and examination of its function in vivo. Our method using transgenesis can be used to explore the function of regulatory and protein-coding sequences obtained from any extinct species in an in vivo model system, providing important insights into gene evolution and diversity.
Titre de l'article
Résurrection in vivo d’un ADN fonctionnel provenant d’un génome éteint
Résurrection in vivo d’un ADN fonctionnel provenant d’un génome éteint
Introduction à l'article
Les auteurs de cet article ont développé une technique qui permet d’examiner in vivo la fonction de régions non-codantes d’ADN provenant d’un génome éteint. Ils appliquent cette technique sur le génome du thylacine. Cette espèce de marsupial n’a pas été choisie au hasard : en plus de représenter un singulier exemple de convergence évolutive avec les chiens, elle fait l’objet d’une controverse quant à sa possible résurrection.
Ainsi, cet article n’intervient pas à proprement parler dans la controverse liée à la résurrection du thylacine, n’en faisant jamais explicitement allusion (les mots désextinction ou résurrection ne sont jamais employés dans l’article). Néanmoins, cette publication reste d’une importance cruciale pour comprendre la controverse car elle apporte la preuve qu’il serait techniquement possible de regénérer un ADN codant appartenant à cette espèce, condition sine qua non à la résurrection du thylacine.
Les auteurs de cet article ont développé une technique qui permet d’examiner in vivo la fonction de régions non-codantes d’ADN provenant d’un génome éteint. Ils appliquent cette technique sur le génome du thylacine. Cette espèce de marsupial n’a pas été choisie au hasard : en plus de représenter un singulier exemple de convergence évolutive avec les chiens, elle fait l’objet d’une controverse quant à sa possible résurrection.
Ainsi, cet article n’intervient pas à proprement parler dans la controverse liée à la résurrection du thylacine, n’en faisant jamais explicitement allusion (les mots désextinction ou résurrection ne sont jamais employés dans l’article). Néanmoins, cette publication reste d’une importance cruciale pour comprendre la controverse car elle apporte la preuve qu’il serait techniquement possible de regénérer un ADN codant appartenant à cette espèce, condition sine qua non à la résurrection du thylacine.
Expériences de l'article
Les auteurs ont extrait de l’ADN à partir de tissus de poche ventrale de jeunes thylacines conservés dans l’éthanol depuis 100 ans. La séquence étudiée est celle de l’activateur transcriptionnel du gène du collagène proa1 (II) (Col2a1) composée de 246 paires de bases. Elle a été choisie car elle est relativement bien conservée chez les mammifères (un organisme de souris peut la reconnaître) et dirige l’expression spécifique des chondrocytes (cellules composant le cartilage) chez la souris.
Cette séquence est amplifiée par PCR. Une fois la séquence obtenue et vérifiée, elle est liée avec le gène LacZ. Cette séquence nouvellement créée est micro-injectée dans les pronuclei de zygotes de souris. Les souris s’accouplent, et on observe deux semaines plus tard l’expression de LacZ par coloration au X-gal chez les souriceaux.
Pour rappel, un activateur transcriptionnel est une protéine qui stimule la transcription. De plus, LacZ est un gène rapporteur (gène dont le produit est facilement observable).
Les auteurs ont extrait de l’ADN à partir de tissus de poche ventrale de jeunes thylacines conservés dans l’éthanol depuis 100 ans. La séquence étudiée est celle de l’activateur transcriptionnel du gène du collagène proa1 (II) (Col2a1) composée de 246 paires de bases. Elle a été choisie car elle est relativement bien conservée chez les mammifères (un organisme de souris peut la reconnaître) et dirige l’expression spécifique des chondrocytes (cellules composant le cartilage) chez la souris.
Cette séquence est amplifiée par PCR. Une fois la séquence obtenue et vérifiée, elle est liée avec le gène LacZ. Cette séquence nouvellement créée est micro-injectée dans les pronuclei de zygotes de souris. Les souris s’accouplent, et on observe deux semaines plus tard l’expression de LacZ par coloration au X-gal chez les souriceaux.
Pour rappel, un activateur transcriptionnel est une protéine qui stimule la transcription. De plus, LacZ est un gène rapporteur (gène dont le produit est facilement observable).
Résultats de l'article
Une coloration complète a été observée chez les quatre fœtus de souriceaux selon un schéma indiquant le développement du cartilage. Ce schéma était identique à celui du gène de souris endogène Col2al et des transgènes de souris. Les coupes transversales histologiques ont confirmé que l'expression de LacZ, dirigée par l'activateur transcriptionnel du thylacine, était limitée aux chondrocytes en développement.
Les autres fœtus non transgéniques ont été utilisés comme contrôles négatifs et n'ont montré aucune coloration.
L'expression de l'activateur Col2a1 du thylacine a dépassé celle de l’activateur Col2a1 endogène (de la souris) et a été limitée aux chondrocytes en développement. Cela confirme que le gène du thylacine Col2al avait un rôle de développement conservé dans la formation du cartilage.
Un fragment d’ADN non codant provenant d’un mammifère éteint a donc pu conduire à l'expression d'un gène rapporteur chez un fœtus de mammifère en développement, n'appartenant pas au même taxon.
Une coloration complète a été observée chez les quatre fœtus de souriceaux selon un schéma indiquant le développement du cartilage. Ce schéma était identique à celui du gène de souris endogène Col2al et des transgènes de souris. Les coupes transversales histologiques ont confirmé que l'expression de LacZ, dirigée par l'activateur transcriptionnel du thylacine, était limitée aux chondrocytes en développement.
Les autres fœtus non transgéniques ont été utilisés comme contrôles négatifs et n'ont montré aucune coloration.
L'expression de l'activateur Col2a1 du thylacine a dépassé celle de l’activateur Col2a1 endogène (de la souris) et a été limitée aux chondrocytes en développement. Cela confirme que le gène du thylacine Col2al avait un rôle de développement conservé dans la formation du cartilage.
Un fragment d’ADN non codant provenant d’un mammifère éteint a donc pu conduire à l'expression d'un gène rapporteur chez un fœtus de mammifère en développement, n'appartenant pas au même taxon.
Rigueur de l'article
Les auteurs sont des biologistes. Andrew J. Pask et Marilyn B. Renfree se sont concentrés sur les marsupiaux durant leur carrière, et notamment sur le thylacine.
Les auteurs n’apparaissent pas comme acteurs de la controverse de la dé-extinction, le but de leur étude était d’étudier cette espèce récemment éteinte, et de mieux comprendre les mécanismes d’évolution. Ils n’ont jamais participé à une étude ou un article citant explicitement le terme « de extinction ».
Les institutions dont font partie les auteurs (MD Anderson Cancer Center, University of Texas et Univeristy of Melbourne) sont reconnues et rigoureuses.
La méthodologie utilisée semble être rigoureuse. Les auteurs prennent de nombreuses précautions lors de la manipulation de l’ADN pour éviter toute contamination (stérilisation sous UV). Avant d’être insérée dans les pronucléi de souris, la séquence est vérifiée par séquençage, comparée avec des bases de données et confirmée par construction d’arbres phylogénétiques.
Les auteurs sont des biologistes. Andrew J. Pask et Marilyn B. Renfree se sont concentrés sur les marsupiaux durant leur carrière, et notamment sur le thylacine.
Les auteurs n’apparaissent pas comme acteurs de la controverse de la dé-extinction, le but de leur étude était d’étudier cette espèce récemment éteinte, et de mieux comprendre les mécanismes d’évolution. Ils n’ont jamais participé à une étude ou un article citant explicitement le terme « de extinction ».
Les institutions dont font partie les auteurs (MD Anderson Cancer Center, University of Texas et Univeristy of Melbourne) sont reconnues et rigoureuses.
La méthodologie utilisée semble être rigoureuse. Les auteurs prennent de nombreuses précautions lors de la manipulation de l’ADN pour éviter toute contamination (stérilisation sous UV). Avant d’être insérée dans les pronucléi de souris, la séquence est vérifiée par séquençage, comparée avec des bases de données et confirmée par construction d’arbres phylogénétiques.
Ce que cet article apporte au débat
Comme expliqué en introduction, cet article ne permet pas d’apporter de nouveaux éléments et arguments dans la controverse de la dé-extinction, en particulier du thylacine. En revanche, il peut être utilisé comme argument valide et pertinent par les défenseurs de la dé-extinction, car il donne un bon espoir de faisabilité technique et biologique du projet.
Comme expliqué en introduction, cet article ne permet pas d’apporter de nouveaux éléments et arguments dans la controverse de la dé-extinction, en particulier du thylacine. En revanche, il peut être utilisé comme argument valide et pertinent par les défenseurs de la dé-extinction, car il donne un bon espoir de faisabilité technique et biologique du projet.
Figure
Figure provenant de l'article.
From extinction to gene expression. Functional analysis of the thylacine non-coding DNA fragment. (a) Diagram of transgene construct. 4 copies of a 264-bp fragment containing the Thylacine Col2a1 enhancer (TcyCol2a1) region was ligated to the human b-globin minimal promoter (black box) and ligated to lacZpA.(b–e) X-gal stained 14.5 dpc TcyCol2a1-lacZpA transgenic mouse embryo showing varying levels of reporter gene expression within the developing cartilage (blue). doi:10.1371/journal.pone.0002240.g003
Figure provenant de l'article.
From extinction to gene expression. Functional analysis of the thylacine non-coding DNA fragment. (a) Diagram of transgene construct. 4 copies of a 264-bp fragment containing the Thylacine Col2a1 enhancer (TcyCol2a1) region was ligated to the human b-globin minimal promoter (black box) and ligated to lacZpA.(b–e) X-gal stained 14.5 dpc TcyCol2a1-lacZpA transgenic mouse embryo showing varying levels of reporter gene expression within the developing cartilage (blue). doi:10.1371/journal.pone.0002240.g003
Dernière modification il y a plus de 7 ans.